• 专利附录
  • 专利说明
  • 权利要求
  • 类似技术
  • 同族专利
  • 引用文献
  • 法律状态
  • 优先权
    • 专利摘要:

    公开号:WO1986004086A1
    申请号:PCT/T1986/000003
    申请日:1986-01-13
    公开日:1986-07-17
    发明作者:Thomas C. Montie；Friedrich Dorner；James L. Mcdonel；Wolfgang Mundt
    申请人:Immuno Aktiengesellschaft Für Chemisch-Medizinisch；
    IPC主号:A61K39-00
    专利说明:
    [0001] Verfahren zur submersen Züchtung von Pseudomonas aeruginosa-Bakteri enstämmen
    [0002] Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur submersen Züchtung von Pseudomonas aeruginosa-Bakterienstämmen aus der taxonomischen Familie der Pseudomonadaceae.
    [0003] Bakterium-Pseudomonas aeruginosa ist ein opportunistischer, pathogener Keim, der häufig bei Krankenhausinfektionen auftritt, hauptsächlich bei Patienten mit geschwächter Immunabwehr, wie bei Verbrennungspatienten, bei Personen, die an cystischer Fibröse leiden oder organische Fehlfunktionen aufweisen, und bei Tumorpatienten. Antibiotika sind gegen Pseudomonasinfektionen infolge des Auftretens von Resistenzen nur beschränkt wirksam, weshalb man bemüht ist, immunologische Methoden zur Bekämpfung von Infektionen durch Pseudomonas aeruginosa anzuwenden.
    [0004] Infektionen können durch eine Vielzahl von Stämmen ausgelöst werden, die O-Gruppenantigene und H-Antigene produzieren. Gemäß dem H-Antigenschema nach Ansorg (Zbl. Bakt. Hyg. I. Abt. Orig. A 242, 228 - 238 (1978)) wird unter Verwendung der indirekten Immunfluoreszenztechnik bei Pseudomonas aeruginosa ein komplexes Flagella-Antigen a mit den Partialantigenen a0, a1, a2, a3, a4 und ein uniformes Flagella-Antigen b differenziert. Die Partialfaktoren a0 - a 4 sind unabhängige Determinanten, so daß ein flagellares Antigenschema mit mehreren H-Typen resultiert. O-Gruppen und H-Typ zeigen freie Kombinationen.
    [0005] Es ist bereits bekannt, zur Prophylaxe gegen Pseudomonasinf ektionen Pseudomonasvakzine herzustellen, wobei als Ausgangsmaterialien entweder Pseudomonas aeruginosa-Bakterienmasse selbst und/oder KuIturfiItrate verwendet werden, die unter Züchtung der Mikroorganismen auf Oberflächenkulturen oder submers in komplexen Nährmedien gewonnen wurden. Bei diesen komplexen Nährmedien wurden neben einer Kohlenstoff- und Energiequelle (meist Kohlenhydrate) und essentiellen Nährsalzen verschiedenste Extrakte und/oder Hydrolysate tierischer, mikrobieller oder pflanzlicher Proteine (sogenannte Peptone) verwendet. Derartige Nährlösungssupplemente sind in ihrer genauen Zusammensetzung nicht definiert und zudem von Charge zu Charge variabel. Sie enthalten neben Aminosäuren auch unvollständig abgebaute Proteinbruchstücke und Undefinierte Komplexe derselben und dienen im wesentlichen zur Deckung des Aminosäure- und Wuchsstoffbedarfes. Kulturüberstände sind deshalb immer reich an Substanzen nicht-bakteriellen Ursprunges, was den Nachteil hat, daß für die Bereitung eines Flagella-Antigens von Pseudomonas aeruginosa immer mehrere der Kultivierungsstufe nachzustellende Trennstufen notwendig sind, um ein immunogen wirksames Flagella-Antigen soweit wie möglich von aus dem Nährmedium stammenden Verunreinigungen zu befreien.
    [0006] Ein weiterer Nachteil der bisherigen Chargen- bzw. "batch"-wei se durchgeführten Züchtungsverfahren besteht darin, daß die Bakterien vom Zeitpunkt ihrer Inokulation bis zum Zeitpunkt ihrer Abtrennung aus der Kultur einem Zustand der kontinuierlichen physiologischen Änderung unterworfen sind. Das auslösende Moment für diese physiologische und daher funktionelle Differenzierung der bakteriellen Biomasse ist durch das Zellwachstum selbst und der damit ursächlich bedingten zeitlichen Veränderung der Zusammensetzung des Nährmediums bedingt. Die sichtbare Folge dieser spontanen physiologischen Differenzierung ist allein schon an den verschiedenen Phasen der Wachstumskurve einer "batch"-KuItur zu ermessen. A l s Konsequenz der beschriebenen direkten Beziehung zwischen der physiologischen Aktivität der Zellmasse einerseits und ihrem Umgebungsmilieu anderseits ist damit auch eine bevorzugte Anreicherung verschiedener intra- und extrazellulärer Stoffwechselprodukte je nach Wachtsumsphase und Differenzierungsphase verbunden. Kulturüberstände einer "batch"-Kultur enthalten deshalb eine integrierte Mischung aller zeitlich über einzelne Differenzierungsphasen gebildeten Stoff wechselprodukte.
    [0007] Die Erfindung bezweckt die Vermeidung dieser Schwierigkeiten und Nachteile und stellt sich die Aufgabe, ein submerses Züchtungsverfahren von Pseudomonas aeruginosa-Bakterienstämmen zu schaffen, welches mit wesentlich besserer Ausbeute als bisher eine bakterielle Biomasse zur Gewinnung von Antigenen liefert, deren physiologischer Zustand während der Gesamtdauer der Kultivierung konstant bleibt; bei welchem ein synthetisches Nährmedium verwendet wird, aus dem keine zusätzlichen Verunreinigungen durch Autoklavieren entstehen; und welches eine erleichterte chemische Aufarbeitung der bakteriellen Biomasse zu Flagella-Antigen ermöglicht.
    [0008] Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die folgenden H-Typ-Antigene produzierenden Stämme
    [0009] Stamm H-Typ
    [0010] 1 170001 b
    [0011] M-2 b
    [0012] 2 5940 a0, a2
    [0013] 3 5939 a0, a3
    [0014] 4 5933 a0, a1, a2 1210 a0, a1, a2
    [0015] 16990 a0, a1, a2
    [0016] 5 170018 a0, a 3 , a 4 in einem wässerigen, antigenfreien und proteinfreien Nährmedium, welches eine Stickstoffquelle und Mineralsalze sowie Succinat oder Harnstoff als Kohlenstoffquelle enthält, gezüchtet werden.
    [0017] Die genannte Kohlenstoffquelle hat sich in besonderem Maß als wachstumsfördernd erwiesen.
    [0018] Für die Stämme 170001, 5940, 5939, 5933 und 170018 ist die Bezeichnung nach Ansorg verwendet. Die Zuordnung der untypisierten Stämme M-2, 1210 und 16990 zum entsprechenden H-Serotyp erfolgte aufgrund von Vergleichsuntersuchungen der Molekulargewichte und serologischen Kreuzreaktionen durch Montie et al.
    [0019] Vorzugsweise wird die Züchtung der Stämme in kontinuierlicher Weise durchgeführt.
    [0020] Nach einer weiteren bevorzugten Arbeitsweise kann die Züchtung auf turbidostati schem Weg erfolgen, wobei der Sauerstoffgehalt im Nährmedium 5 bis 20 % , vorzugsweise etwa 10 %, beträgt, die Zelldichte auf 2 - 3 x 109 Zellen/ml gehalten und eine Verdünnungsrate des Substrates durch Zuführung von frischem Nährmedium auf 0,1 My bis 0,3 My eingehalten wird.
    [0021] Die erfindungsgemäße Züchtung der Pseudomonas aeruginosa-Bakterienstämme erfolgt unter Agitation und Belüftung einer "offenen Kultur" in solcher Weise, daß sie zum maximalen Wachstum und Ausbildung der Flagellen veranlaßt werden. Die Zufuhr des Nährsubstrates wird in Abhängigkeit von der Wachstumsrate der Kultur bzw. vom Gleichgewichtszustand, den die Kultur erreicht hat, vorgenommen. Die Regelung bzw. Steuerung der Zufuhr von frischem Nährmedium erfolgt in Abhängigkeit von einem dem
    [0022] Wachstum der Kultur proportionalen Parameter, vorzugsweise der zeitlichen Veränderung der Zelldichte. Es können jedoch auch andere Parameter, die der Entwicklung der Kultur proportional sind, wie Atmungsaktivität, CO2- Produktion, Änderung der Wasserstoff ionenkonzentration, Änderung der Kohlenstoffquellenkonzentration, Respirationsquotient, Stickstoffverbrauch, Sauerstoff verbrauch und Wärmetönung, herangezogen werden. Weiters kann die Regelung der Zufuhr von frischem Nährmedium in Abhängigkeit von der Menge des gebildeten Antigens erfolgen.
    [0023] Bei der erfindungsgemäßen kontinuierlichen Züchtungsmethode wird gleichzeitig mit der Zufuhr von frischem Nährmedium Kulturflüssigkeit aus dem Züchtungsgefäß abgezogen, so daß sich zwischen dem Wachstum und der physiologischen Aktivität, insbesondere der Bildung von Zellen einerseits und dem Umgebungsmilieu der Zellen anderseits, ein genau definierbarer und jederzeit reproduzierbarer Fließgleichgewichtszustand einstellt, welcher auf praktisch zeitlich unbegrenzte Dauer erhalten werden kann.
    [0024] Als Nährmedium wird ein synthetisches proteinfreies Medium verwendet, welches ausschließlich chemisch sowie physi kochemi seh qualitativ, und quantitativ erfaßbare Bestandteile enthält. Geeignet ist eine anorganische Nährlösung, die alle essentiellen Elemente enthält.
    [0025] Beim bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren sind für die fermentative Produktion der Keime sowohl das chemostatische Prinzip der kontinuierlichen Kultur, bei welchem die physiologische Aktivität der Kultur durch ein limitierendes Substrat, vorzugsweise der Kohlenstoff- und Energiequelle, reguliert wird, wie auch das turbidostatische Prinzip der kontinuierlichen Kultur, bei welchem die Verdünnungsgeschwindigkeit (My) und damit die physiologische Aktivität der Kultur extern über einen Wachstumsparameter, vorzugsweise über die augenblickliche Zelldichte der Kultur, reguliert wird, anwendbar.
    [0026] Vorzugsweise wird die turbidostatische kontinuierliche Kultivierung angewendet.
    [0027] Um ein maximales Bakterienwachstum zu fördern, sind auch die Temperaturen bzw. der pH-Wert von Bedeutung; so soll zweckmäßig während der Züchtung eine Temperatur von 20 bis 35°C, vorzugsweise 30°C, und ein pH-Wert von 6,5 bis 7,5, vorzugsweise 7,0, eingehalten werden.
    [0028] Im einzelnen wird das erfindungsgemäße Verfahren bei turbidostatischer Arbeitsweise in einem Fermentor durchgeführt, indem zunächst das Nährmedium mit einem Bakterienstamm beimpft und unter Einhaltung der angegebenen Bedingungen gearbeitet wird, bis die angegebene Zelldichte von 2 - 3 x 109 Zellen/ml in der logarithmischen Endphase erreicht wird. Sobald dies der Fall ist, wird aus dem Fermentor Bakteriensuspension kontinuierlich abgezogen und durch frische Nährlösung kontinuierlich ersetzt. Die Verdünnungsrate soll zweckmäßig nicht mehr als 0,3 My, vorzugsweise 0,1 bis 0,2 My, betragen.
    [0029] Unter den angegebenen Bedingungen werden nach Erreichen des Fließgleichgewichtszustandes 1,5 bis 2,0 g/l nasse Zellen erhalten, was einem Trübungswert der Suspension vor der Zentrifugierung bei 590 nm nach der Methode von Tyndall von 0,5 bis 0,7 entspricht.
    [0030] Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch das folgende Beispiel näher erläutert: Beispiel :
    [0031] Es wurde eine Nährlösung folgender Zusammensetzung verwendet :
    [0032] Dinatriumsuccinat 4,05 g/l,
    [0033] Dikaliummonohydrogenphosphat 7 g/l,
    [0034] Kaliumdihydrogenphosphat 3 g/l,
    [0035] Ammoniumhydrogenphosphat 1 g/l,
    [0036] Magnesiumsulfat 7 H2O 0,05 g/l,
    [0037] Eisen(IlI)chlorid 0,0025 g/l, der pH-Wert auf 7,0 eingestellt und die Temperatur auf 30°C gebracht. Die Nährlösung wurde mit dem Stamm Pseudomonas aeruginosa M-2 beimpft und in einen 15 l Fermentor eingebracht. Während einer Fermentationsdauer von 96 Stunden wurden 140 l des Nährmediums durchgesetzt, wobei der Luftdurchsatz 10 % pO2 (Sauerstoffpartialdruck) betrug. Die Verdünnungsrate betrug 0,1 My. Die Zelldichte nach Erreichen des Fließgleichgewichtszustandes betrug 2 - 3 x 109 Zellen/ml.
    [0038] Unter den gleichen Bedingungen wurden die Stämme 170001 und 1210 kultiviert, wobei in der folgenden Tabelle die Kulturbedingungen, Verdünnungsrate, Sauerstoffpartialdruck in % und Zellenausbeute in g/l Naßgewicht nach zweimaliger Zentrifugation bei 15000 x g ersichtlich ist. Weiters sind die Trübungswerte der Suspension vor der Zentrifugierung angegeben.
    [0039]
    权利要求:
    ClaimsPatentansprüche:
    1. Verfahren zur submersen Züchtung von Pseudomonas aeruginosa-Bakterienstämmen aus der taxonomi sehen Familie der Pseudomonadaceae, dadurch gekennzeichnet, daß die folgenden H-Typ-Antigene produzierenden Stämme
    Stamm H-Typ
    1 170001 - b M-2 - b
    2 5940 - a0, a2
    3 5939 - a0, a3
    4 5933 - a0, a1, a2 1210 - a0, a1, a2 16990 - a0, a 1, a2
    5 170018 - a0, a3, a4
    in einem wässerigen, antigenfreien und proteinfreien Nährmedium, welches eine Stickstoffquelle und Mineralsalze sowie Succinat oder Harnstoff als Kohlenstoffquelle enthält, gezüchtet werden.
    2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtung in kontinuierlicher Weise erfolgt.
    3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtung auf turbidostatischem Weg erfolgt, wobei der Sauerstoff gehaIt im Nährmedium 5 bis 20 % , vorzugsweise etwa 10 % , beträgt, die Zelldichte auf 2 - 3 x 109 Zellen/ml gehalten und eine Verdünnungsrate des Substrates durch Zuführung von frischem Nährmedium auf 0,1 My bis 0,3 My eingehalten wird.
    4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß während der Züchtung eine Temperatur von 20 bis 35°C, vorzugsweise 30°C, und ein pH-Wert von 6,5 bis 7,5, vorzugsweise 7,0, eingehalten werden.
    类似技术:
    公开号 | 公开日 | 专利标题
    Epps et al.1942|The influence of the presence of glucose during growth on the enzymic activities of Escherichia coli: comparison of the effect with that produced by fermentation acids
    Wayne et al.1998|Nitrate reduction as a marker for hypoxic shiftdown of Mycobacterium tuberculosis
    Alphen et al.1977|Influence of osmolarity of the growth medium on the outer membrane protein pattern of Escherichia coli.
    EP0593792B2|2004-01-07|Neuartiges L-threoninproduzierendes Mikrobakterium und eine Herstellungsmethode für L-Threonin
    Chung et al.1989|In vitro studies on reuterin synthesis by Lactobacillus reuteri
    Frengova et al.1994|Formation of carotenoids by Rhodotorula glutinis in whey ultrafiltrate
    EP0604631B1|2000-11-22|Verwendung von Bakterienhüllen der Ordnung Beggiatoales oder der Gattung Vitreoscilla als aktiven Bestandteil eines Medikamentes zur Stimulierung der unspezifischen Immunität
    DE69838383T2|2008-06-05|Kulturmedium mit sojabohnenextrakt als aminosäuren-quelle und ohne proteinkomplexe tierischen ursprungs
    JP3698758B2|2005-09-21|発酵法によるｌ−ロイシンの製造法
    Nakano et al.1997|Influence of acetic acid on the growth of Escherichia coli K12 during high-cell-density cultivation in a dialysis reactor
    CA2145630C|2003-09-09|Microorganisms for the production of tryptophan and process for producing the same
    ES2285757T3|2007-11-16|Procedimiento para producir acidos dicarboxilicos.
    Hino et al.1958|Nitrogen fixation by a facultative bacillus
    US7329513B2|2008-02-12|High level constitutive production of anthrax protective antigen
    Son et al.2001|Optimization of fermentation conditions for the production of bacterial cellulose by a newly isolated Acetobacter
    Newton et al.1978|The development of the anaerobic spoilage flora of meat stored at chill temperatures
    JP4734775B2|2011-07-27|エシェリヒア・コリのアルギニン生産菌及びそれを用いたｌ−アルギニンの製造法
    Roberts et al.1968|New procedures for purification of L-asparaginase with high yield from Escherichia coli
    Brubaker et al.1964|The Effect of and on Lysis, Growth, and Production of Virulence Antigens by Pasteurella pestis
    Frantz Jr1942|Growth requirements of the meningococcus
    US4579733A|1986-04-01|Hypocholesterolemically and/or hypotriglyceridemically active products
    EP0077014A2|1983-04-20|Verfahren zur Herstellung von Wasserstoff durch Algen in einem Zyklus von Licht und Dunkel
    Häggström et al.1980|Calcium alginate immobilized cells of Clostridium acetobutylicum for solvent production
    Bouvet et al.1981|Nutritionally variant streptococci from patients with endocarditis: growth parameters in a semisynthetic medium and demonstration of a chromophore.
    Ben-Efraim et al.1961|New antigenic component of Pasteurella pestis formed under specified conditions of pH and temperature
    同族专利:
    公开号 | 公开日
    EP0211014B1|1990-09-26|
    CA1273887A1||
    ES550832A0|1987-07-01|
    DK421386A|1986-09-03|
    ES8706820A1|1987-07-01|
    DK421386D0|1986-09-03|
    DE3674502D1|1990-10-31|
    AT384238B|1987-10-12|
    JPH07114690B2|1995-12-13|
    FI863678D0||
    FI84280C|1991-11-11|
    EP0211014A1|1987-02-25|
    ES550832D0||
    FI863678A0|1986-09-11|
    FI84280B|1991-07-31|
    JPS62501330A|1987-06-04|
    AT56988T|1990-10-15|
    ATA7385A|1987-03-15|
    CA1273887A|1990-09-11|
    FI863678A|1986-09-11|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1986-07-17| AL| Designated countries for regional patents|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AT BE CH DE FR GB IT LU NL SE |
    1986-07-17| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): DK FI JP US |
    1986-09-04| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 1986900708 Country of ref document: EP |
    1986-09-11| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 863678 Country of ref document: FI |
    1987-02-25| WWP| Wipo information: published in national office|Ref document number: 1986900708 Country of ref document: EP |
    1990-09-26| WWG| Wipo information: grant in national office|Ref document number: 1986900708 Country of ref document: EP |
    1991-11-11| WWG| Wipo information: grant in national office|Ref document number: 863678 Country of ref document: FI |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    AT0007385A|AT384238B|1985-01-14|1985-01-14|Verfahren zur submersen zuechtung von pseudomonas aeruginosa-bakterienstaemmen|
    ATA73/85||1985-01-14||AT86900708T| AT56988T|1985-01-14|1986-01-13|Verfahren zur submersen zuechtung von pseudomonas aeruginosa-bakterienstaemmen.|
    JP61500682A| JPH07114690B2|1985-01-14|1986-01-13|シュ−ドモナス・アエルギノサ細菌株を溶液中で増殖させる方法|
    DE8686900708A| DE3674502D1|1985-01-14|1986-01-13|Verfahren zur submersen zuechtung von pseudomonas aeruginosa-bakterienstaemmen.|
    DK421386A| DK421386A|1985-01-14|1986-09-03|Fremgangsmaade til submers dyrkning af pseudomonas aeruginosa bakteriestammer|
    FI863678A| FI84280C|1985-01-14|1986-09-11|Foerfarande foer en submers odling av pseudomonas aeruginosa-bakteriestammar.|
    [返回顶部]